QuanNUA 核酸分型質(zhì)譜的 10 種鴨源性致病病毒的快速檢測(cè)，方法特異性良好

儀器與試劑

目標(biāo)鴨源性病原體包括 DHAV-1 分離株 C80（DQ864514）、DHAV-3 分離株 C-GY（EU352805）、DAstV-1 分離株 D17（MN149392）、DAstV-2 分離株 SL4 （KF753806）、DRV-1 分離株 815-12（KC508656）、DRV-2 分離株 091（JX478256）、 TMUV 分離物 PS（KT876991）、GPV 分離物 JS1（KT935531）和 DEV 來自中國 農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院。AIV 亞型 H9N2（GQ373128）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)禽流感實(shí)驗(yàn)室 提供。所有這些病毒在檢測(cè)前均經(jīng) RT-PCR/PCR 鑒定。非靶標(biāo)鴨源性病原菌包括 大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里默氏菌，均來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院。2.5×PCR mix、質(zhì)量探針試劑盒，以及 QuanTOF 質(zhì)譜儀及 QuanNUA 軟件，均來自于融智 生物科技（青島）有限公司

實(shí)驗(yàn)方法

分別下載 10 種病毒的基因組序列，針對(duì)選定的靶基因，設(shè)計(jì)質(zhì)粒構(gòu)建用引物和檢測(cè)用引物，分別構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn) 質(zhì)粒，建立檢測(cè)方法，并確定檢測(cè)方法的特異性；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行 10 倍系列稀釋，確定該方法的敏感性。利用該 檢測(cè)方法對(duì)人工制備的混合感染樣品進(jìn)行檢測(cè)，與普通 PCR 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。 結(jié)果與討論 結(jié)果顯示，本研究所建立的檢測(cè)方法可同時(shí)檢測(cè)到包括鴨甲肝病毒 1 型、鴨甲肝病毒 3 型、鴨星狀病毒 1 型、 鴨星狀病毒 2 型、鴨呼腸孤病毒 1 型、鴨呼腸孤病毒 2 型、坦布蘇病毒、禽流感病毒、小鵝瘟病毒和鴨病毒性腸 炎病毒等 10 種病毒和 1 種內(nèi)參基因，且 10 種病毒之間的檢測(cè)結(jié)果互不干擾；對(duì) 10 倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)， 當(dāng)稀釋度為 10-10 時(shí)仍能檢測(cè)到核酸，針對(duì)不同病毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒最低檢出量為 1.3~7.8 × 100 copies，對(duì)混合樣 品的檢測(cè)結(jié)果與普通 PCR 結(jié)果一致。

研究人員用已知含有特定病毒的臨床樣品模擬了四種混合感染，對(duì)該方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。如預(yù)期的那樣，在所 有的樣本中，都能準(zhǔn)確地識(shí)別出目的病毒，包括 RNA 和 DNA 病毒。

結(jié)果

綜 上 所 述， 本 研 究 建 立 的 基 于 QuanNUA 核酸分型質(zhì)譜的 10 種鴨源性致病病毒的快速檢 測(cè)，方法特異性良好，與普通 PCR 相比，基于 QuanNUA 核酸分型質(zhì)譜的檢測(cè)方法的靈敏度大大 提高，并可對(duì)同一樣品進(jìn)行多種病毒的檢測(cè)，使整 體檢測(cè)成本下降，不同病毒之間的檢測(cè)結(jié)果互不干 擾，可為鴨病毒病病原的快速診斷和分子流行病毒 學(xué)調(diào)查提供極大便利?；诤怂豳|(zhì)譜的檢測(cè)方法， 可實(shí)現(xiàn)對(duì)無法以核糖體蛋白作為生物標(biāo)志物的微生 物進(jìn)行檢測(cè)，使 MALDI-TOF MS 有望成為對(duì)此類 微生物進(jìn)行快速、高靈敏分型鑒定的新的有效工 具，具有一定的應(yīng)用推廣潛力。

參考文獻(xiàn)

Establishment of a simultaneous detection method for ten duck viruses using MALDI-TOF mass spectrometry. Ning Liua,Lei Wanga,Gaozhe Caib,et al. [J].Journal of Virological Methods, 273 (2019) 113723.